Chương VII: Kính hiển vi quang học, cấu tạo, nguyên tắc hoạt động
Giới thiệu một số loại kính hiển vi quang học thường được sử dụng trong các phòng xét nghiệm vi sinh ở Việt Nam.
Kính hiển vi soi nổi (stereoscopic microscope) là loại kính hiển vi quang học được thiết kế để quan sát hình ảnh bề mặt của mẫu vật thể ở độ phóng đại thấp. Loại kính này thường sử dụng chùm ánh sáng trắng chiếu tới bề mặt của vật thể, hình ảnh tạo ra bởi ánh sáng phản xạ thông qua hai trục quang học riêng biệt với hai vật kính (hoặc một vật kính phẳng), hệ thống kính phóng và đến thị kính. Ảnh của mẫu vật thường là hình ảnh 3 chiều.
Chương VII: Kính hiển vi quang học, cấu tạo, nguyên tắc hoạt động
Cấu tạo Kính hiển vi soi nổi gồm các bộ phận chính sau:
- Nguồn sáng phản xạ (và truyền qua)
- Bệ kính giữ thăng bằng có giá đặt mẫu
- Lăng kính
- Ống quan sát
- Vật kính : thường bao gồm hai vật kính hoặc vật kính phẳng cố định, cho phép quan sát mẫu vật ở các góc độ khác nhau. Độ phóng đại điển hình của vật kính : 1x ; 1,5x ; 2x.
- Núm chỉnh độ phóng đại
- Núm chỉnh độ hội tụ
- Thị kính : là một ống hình trụ mang thấu kính. Độ phóng đại điển hình của thị kính : 10x, 15x, 20x và 30x
- Ống nối camera (nếu có)
Nguyên tắc hoạt động:
Kính hiển vi soi nổi được thiết kế để quan sát mẫu vật thể ở độ phóng đại thấp. Ảnh hiển vi soi nổi thường được tạo thành nhờ ánh sáng phản xạ trên bề mặt mẫu sau khi được chiếu sáng hơn là ánh sáng truyền qua. Ánh sáng phản xạ đi qua hai vật kính hoặc một vật kính phẳng theo hai trục quang học song song tạo nên hình ảnh ba chiều nhờ khả năng quan sát mẫu từ các góc độ khác nhau (γ). Nhờ sử dụng các kính viễn vọng kiểu Galileo đặt trên một trống xoay (hoặc hệ thống các thấu kính có khả năng phóng to hoặc thu nhỏ) nên có khả năng thay đổi được độ phóng đại của ảnh theo ý muốn.
Kính hiển vi ánh sáng truyền qua (transmitted light microscope) là loại kính hiển vi quang học được sử dụng phổ biến nhất hiện nay, thường sử dụng một nguồn ánh sáng trắng rọi qua mẫu đặt trên một lam kính để quan sát hình dạng và vi cấu trúc của mẫu. Ảnh của mẫu là hình ảnh hai chiều.
Cấu tạo Kính hiển vi ánh sáng truyền qua gồm các bộ phận chính sau
- Nguồn sáng truyền qua (bóng đèn sợi đốt hoặc halogen).
- Tụ quang để hội tụ chùm sáng
- Màn chắn sáng, khẩu độ chắn sáng (nếu có)
- Giá đỡ mẫu (có bộ phận giữ mẫu)
- Bộ phận điều khiển giá đỡ mẫu (lên, xuống, sang phải, sang trái)
- Mâm vật kính có khả năng xoay vòng để lựa chọn vật kính có độ phóng đại thích hợp khi quan sát
- Vật kính: là một ống hình trụ có một hay nhiều thấu kính, để thu ánh sáng đi xuyên qua mẫu. Vật kính có các độ phóng đại điển hình như 4x, 5x, 10x, 20x, 40x, 50x, 60x và 100x có thể được lắp đặt trên cùng một mâm vật kính.
- Thị kính: là một ống hình trụ có hai hay nhiều thấu kính, giúp hội tụ hình ảnh của mẫu vật lên võng mạc của mắt. Độ phóng đại điển hình của thị kính là 2x, 5x, 10x.
- Núm chỉnh độ hội tụ (chỉnh thô và chỉnh tinh)
- Ống nối với camera (nếu có).
Nguyên tắc hoạt động:
Ánh sáng khả kiến từ nguồn được tập trung lại khi đi qua tụ quang để truyền qua mẫu đặt trên lam kính. Sau đó, ảnh của mẫu được tạo thành và phóng đại lần thứ nhất nhờ một thấu kính có tiêu cự ngắn (vài mm) gọi là vật kính. Hình ảnh này có thể tiếp tục được phóng đại lên nhiều lần nhờ thấu kính phóng. Hình ảnh phóng đại cuối cùng của mẫu là ảnh thật, quan sát được nhờ thị kính (có tiêu cực dài hơn rất nhiều so với tiêu cự của vật kính) hoặc được ghi lại nhờ CCD camera. Độ phân giải của ảnh hiển vi quang học bị hạn chế bởi nhiễu xạ. Theo công thức của Abbe – Rayleigh, khoảng cách nhỏ nhất dmin giữa hai điểm có khả năng phân biệt được tính theo công thức: dmin = 1,22l/2NA trong đó l là bước sóng ánh sáng, NA = n x sinα được gọi là khẩu độ số của vật kính, n là chiết suất của môi trường mẫu quan sát, α là bán góc mở cực đại của vật kính khi quan sát mẫu.
Kính hiển vi phân cực (polarizing microscope) là loại kính hiển vi quang học sử dụng ánh sáng phân cực để quan sát, nghiên cứu định tính và định lượng những mẫu có đặc tính lưỡng chiết (có hai chỉ số khúc xạ). Kính hiển vi phân cực có khả năng cung cấp những thông tin về màu hấp thụ và đường biên quang học giữa các chất liệu khác nhau (có chỉ só khúc xạ khác nhau) trong cùng một mẫu. Hình ảnh hiển vi phân cực có độ tương phản cao.
Cấu tạo Kính hiển vi phân cực gồm các bộ phận chính sau:
- Nguồn sáng (sợi đốt, halogen…)
- Tụ quang
- Bộ phân cực ánh sáng (thường được lắp cố định phía dưới tụ quang)
- Giá đỡ mẫu có khả năng xoay vòng
- Mâm vật kính
- Bộ phân tích (có khả năng xoay vòng với góc đọc nhỏ)
- Vật kính: là một ống hình trụ có một hay nhiều thấu kính, để thu ánh sáng đi xuyên qua mẫu. Vật kính có các độ phóng đại điển hình khác nhau như 4x, 5x, 10x, 20x, 40x, 50x, 60x và 100x có thể được lắp đặt trên cùng một mâm vật kính.
- Thị kính: là một ống hình trụ có hai hay nhiều thấu kính, giúp hội tụ hình ảnh của mẫu vật lên võng mạc của mắt. Độ phóng đại điển hình của thị kính là 2x, 5x, 10x.
- Núm chỉnh độ hội tụ (chỉnh thô, chỉnh tinh)
- Bệ đỡ kính
- Ống nối với camera (nếu có)
Nguyên tắc hoạt động:
Không giống như các loại kính hiển vi quang học khác, kính hiển vi phân cực được thiết kế để quan sát mẫu khi sử dụng ánh sáng phân cực và đặc tính quang học không đẳng hướng của mẫu. Loại mẫu này có những liên kết nội phân tử phân cực tương tác với ánh sáng phân cực theo một hướng nhất định dẫn đến sự trễ pha. Quá trình này được kiểm soát nhờ sự biến đổi biên độ giao thoa tại mặt phẳng tạo ảnh ban đầu. Để quan sát các mẫu lưỡng chiết (có hai chỉ số khúc xạ khác nhau), kính hiển vi phải được trang bị hai bộ phân cực, một bộ đặt trên đường đi của chùm ánh sáng tới trước mẫu, bộ phân tích (bộ phân cực thứ hai) được đặt ở trục quang học giữa vật kính, sau khẩu độ và các ống quan sát hoặc camera. Độ tương phản của ảnh tạo ra nhờ tương tác giữa ánh sáng phân cực phẳng với mẫu lưỡng chiết để tạo ra hai thành phần sóng riêng biệt (tia bình thường và bất bình thường) phân cực trong các mặt phẳng vuông góc thay đổi lẫn nhau. Tốc độ của các thành phần này khác nhau và thay đổi hướng truyền khi đi qua mẫu. Sau khi đi qua mẫu, các thành phần ánh sáng truyền lệch pha nhau nhưng tái kết hợp lại sau quá trình giao thoa khi đi qua bộ phân tích.
Kính hiển vi huỳnh quang (flourescence microscope) là loại kính hiển vi quang học sử dụng một nguồn ánh sáng kích thích để nghiên cứu, quan sát các thuộc tính của mẫu sinh học sau khi mẫu này nhuộm với chất phát huỳnh quang (hoặc mẫu tự phát huỳnh quang). Kỹ thuật hiển vi huỳnh quang cũng cho phép quan sát những thuộc tính sinh hóa và sinh lý học của các tế bào sống. Phụ thuộc vào mục đích và đối tượng cần quan sát mà mẫu có thể nhuộm với những chất phát huỳnh quang khác nhau sử dụng ánh sáng có bước sóng kích thích khác nhau.
Cấu tạo Kính hiển vi huỳnh quang cực gồm các bộ phận chính sau:
- Nguồn sáng truyền qua (bóng đèn sợi đốt hoặc halogen)
- Nguồn sáng kích thích huỳnh quang (đèn hơi thủy ngân, đèn hồ quang xenon…)
- Tụ quang để hội tụ chùm sáng
- Màn chắn sáng, khẩu độ chắn sáng
- Gương lưỡng hướng sắc (hoặc bộ phân chia chùm tia lưỡng sắc)
- Giá đỡ mẫu (có bộ phận giữ mẫu)
- Bộ phận điều khiển giá đỡ mẫu (lên, xuống, sang phải, sang trái)
- Mâm vật kính có khả năng xoay vòng để lựa chọn vật kính có độ phóng đại thích hợp khi quan sát.
- Vật kính : là một ống hình trụ có một hay nhiều thấu kính, để thu ánh sáng đi xuyên qua mẫu. Vật kính có các độ phóng đại điển hình như 4x, 5x, 10x, 20x, 40x, 50x, 60x và 100x có thể được lắp đặt trên cùng một mâm vật kính.
- Thị kính : là một ống hình trụ có hai hay nhiều thấu kính, giúp hội tụ hình ảnh của mẫu vật lên võng mạc của mắt. Độ phóng đại điển hình của thị kính là 2x, 5x, 10x
- Núm chỉnh độ hội tụ (chỉnh thô và chỉnh tinh)
- Ống nối với camera
Nguyên tắc hoạt động:
Kính hiển vi huỳnh quang hoạt động dựa trên nguyên lý sử dụng ánh sáng có bước sóng ngắn, năng lượng cao để kích thích các điện tử nội tại trong phân tử của mẫu nhảy lên quỹ đạo cao hơn (có mức năng lượng cao hơn). Khi các điện tử này quay trở lại quỹ đạo cũ (có mức năng lượng ban đầu khi chưa bị kích thích) chúng phát ra một ánh sáng có bước sóng dài hơn, năng lượng thấp hơn (thường nằm trong phổ ánh ánh sáng nhìn thấy) để tạo ra hình ảnh huỳnh quang. Kính hiển vi huỳnh quang sử dụng đèn xenon hoặc thủy ngân để tạo ra ánh sáng tia cực tím, qua bộ lọc để dẫn vào kính và đi đến gương lưỡng hướng sắc – loại gương có khả năng phản xạ dải bước bước sóng nhất định và cho phép một dải bước sóng khác đi qua. Gương này phản xạ ánh sáng tia cực tím lên mẫu để kích thích huỳnh quang nội tại trong các phân tử của mẫu. Vật kính sẽ thu lại những ánh sáng có bước sóng huỳnh quang được tạo ra đi đến gương lưỡng hướng sắc và thông qua một bộ lọc (để loại bỏ những ánh sáng không có bước sóng huỳnh quang) dẫn đến thị kính để tạo ảnh huỳnh quang.
Lịch sử kính hiển vi quang học :
Kính hiển vi (microscope) là thiết bị để quan sát các vật thể có kích thước rất nhỏ mà mắt thường không nhìn thấy được. Khoa học nhằm khám phá và kiểm tra những vật thể nhỏ nhờ một thiết bị như vậy được gọi là khoa học hiển vi (microscopy). Hình ảnh hiển vi của vật thể được phóng đại thông qua một hoặc nhiều thấu kính, hình ảnh này nằm trong mặt phẳng vuông góc với trục của thấu kính (hoặc các thấu kính). Khả năng quan sát của kính hiển vi được quyết định bởi độ phân giải.
Năm 1590, hai cha con thợ làm kính mắt người Hà Lan: Hans Janssen và Zaccharias Janssen đã phát minh ra kính hiển vi đầu tiên. Sau đó, Anton van Leeuwenhoek (1623 – 1732) Hà Lan. Là người đầu tiên chế tạo ra kính hiển vi để quan sát tế bào hồng cầu, nấm, vi khuẩn, tinh trùng và các vi sinh vật trong nước… Từ đó, rất nhiều khám phá và công trình nghiên cứu được công bố, Anton van Leeuwenhoek được coi là “Cha đẻ của khoa học hiển vi – Father of Microscopy) cho dù ông chưa từng được học qua trường lớp nào. Robert Hook (1635 – 1703) đã sử dụng nguồn sáng để quan sát thế giới vi sinh vật bằng kính hiển vi, ông cũng chính là người đầu tiên quan sát được cấu trúc tế bào. Cuốn sách “Hình ảnh hiển vi” được xuất bản năm 1665 đã mô tả rất nhiều đối tượng mà mắt thường không nhìn thấy được. Ông cũng được tôn vinh là “Cha đẻ của khoa học hiển vi người Anh”.